發(fā)酵工程碩士論文


谷胱甘肽發(fā)酵條件的優(yōu)化擴(kuò)大及其分離純化

英文題目：  The Optimization and Amplification of Fermentation
Conditions of Glutathione and its Separation and Purification

申請(qǐng)學(xué)位學(xué)科專業(yè)：發(fā)酵工程

摘   要
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥、抑制艾滋病毒、提高人體免疫力等重要生理功能，在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的市場(chǎng)前景?，F(xiàn)有GSH生產(chǎn)能力遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，所以采用GSH高產(chǎn)菌株發(fā)酵廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH，建立適合工業(yè)化分離純化GSH的方法會(huì)帶來巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14為材料，分別從以下四個(gè)方面進(jìn)行研究：
(1) 利用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到的最適培養(yǎng)基配方為: 葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4 8g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4 0.15g/L。對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，GSH產(chǎn)量可達(dá)到124.77mg/L。
(2) 利用單因素試驗(yàn)對(duì)啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果得到搖瓶最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、初始pH6.0、搖床轉(zhuǎn)速180rpm、搖瓶裝液量30mL/300mL、補(bǔ)料培養(yǎng)基添加時(shí)間20h。在此條件下，菌體胞內(nèi)GSH含量達(dá)到31.56mg/g，GSH的產(chǎn)量可達(dá)249.2mg/L，較原來提高了102%。
(3) 利用10L自動(dòng)發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)啤酒酵母Y-14，①采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法，測(cè)得GSH的產(chǎn)量在52h時(shí)，達(dá)到最大值243mg/L。②采用恒速流加全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，36h時(shí)添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的方法，測(cè)得GSH產(chǎn)量在52h達(dá)到最大值520.742mg/L。比較發(fā)現(xiàn)，第二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體干重、GSH產(chǎn)量較第一批分別提高了122.5%、114.2%。
(4) 采用D001大孔樹脂粗分離GSH，得到最佳分離條件為：上樣pH3.0，濃度為61.4mg/100mL，流速為0.5mL/min，洗雜質(zhì)用液為無水乙醇，洗脫液為1.5% HCl + 0.3mol/L NaCl，流速為3mL/min。GSH的平均收得率為69.11%，蛋白質(zhì)去除率為64.8%。然后通過SephadexG-10脫鹽純化GSH，得到最適條件：Φ1.6cm×25cm玻璃層析柱，上樣濃度為116.66mg/100mL，上樣體積為20mL。結(jié)果GSH的平均收得率為96.21%。最后SephadexG-10分級(jí)分離純化GSH，采用Φ1.6cm×50cm玻璃層析柱，最適上樣體積為2mL，GSH的平均收得率為99.26%，蛋白質(zhì)去除率為56.5%。GSH濃縮倍數(shù)平均為9.07倍，純化倍數(shù)為8.67倍。
關(guān)鍵詞： 啤酒酵母Y-14，谷胱甘肽，發(fā)酵罐，D001大孔樹脂，SephadexG-10
 
Abstract
Glutathione (GSH) is a tripeptide formed by glutamic acid, cysteine and glycin, it has important physiological functions such as removing free radical, detoxification,  anti-aging, diabetes and cancer prevention, inhibition of HIV and improve the effectiveness of the human immune system, and has a wide range of market prospects in the fields of medical, food and cosmetics. But the existing production capacity of GSH is far from the market demand.Use microbial fermentation to translate cheap raw materials into high yielded GSH, and establish suitable industrialization separation and purification of GSH will bring enormous social and economic benefits. In this paper, the main research content and results are as follows:
(1) Using Plackett-Burman and Box-Behnken experimental design optimized medium of Saccharomyces cerevisiae Y-14 which producing GSH. The optimum medium was glucose 20g/mL, yeast extract 10g/mL, (NH4)2SO4 8 g/mL, KH2PO4 3 g/mL, MgSO4 0.15 g/mL. The optimum experiment showed that GSH yield reached to 124.77mg/L.
(2) Using single factor test studied the fermentation conditions of yeast Y-14 producing GSH. The optimum shake-flask fermentation conditions was culture temperature 30 ℃, initial pH6.0, shake speed 180rpm, liquid volume 30mL / 300mL, medium batch add time 20h. GSH content reached to 31.56mg/g, GSH yield reached to 249.2mg/L, increased 102% compare to the original.
(3) Using 10L automated fermentor, ① using single constant speed fed glucose medium, added precursors of amino acids and ATP at 20h, and the GSH yield reached to maximum 243mg /L at 52h. ② using constant flow increases total nutrient medium, added fed medium at 36h , GSH yield maximum reached to 520.742mg/L. It showed that dry cell weight and GSH yield increased 122.5%and 114.2% respectively compared to the first fermentor cultivation.
    (4) Using D001 macroporous resin rough to separate GSH, the optimum separation conditions was:sample pH3.0, sample concentration was 61.4mg/100mL, sample flow rate of 0.5mL/min, impurities washing liquid was absolute alcohol, eluate was 1.5% HCl and 0.3 mol/L NaCl, elution flow rate was 3mL/min, the average yield of GSH was 69.11%, protein removal rate was 64.8%. Then using Sephadex G-10 to desalt and purify GSH, the optimum conditions was:Φ1.6cm×25cm chromatography columns, sample concentration was 116.66mg/100mL, sample volume was 20mL. The average yield of GSH was 96.21%. In the end,using Sephadex G-10 to purify GSH, using Φ1.6cm × 50cm chromatography columns, the optimum sample volume was 2mL, the average yield of GSH was 99.26%, protein removal rate was 56.5%. The average of concentration multiple and purification multiple was 9.07 and 8.67 respectively.
Keywords：Saccharomyces cerevisiae Y-14, Glutathione, Fermentor, D001 macroporous resin,  Sephadex G-10
 
目   錄
摘   要 I
Abstract II
目   錄 III
第1章 引 言 1
1.1 谷胱甘肽概述 1
1.1.1 谷胱甘肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 1
1.1.2 谷胱甘肽的生理功能及其應(yīng)用 3
1.2 發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài) 4
1.3 本研究的意義、目的及內(nèi)容 9
1.3.1 意義 9
1.3.2 目的 9
1.3.3 研究?jī)?nèi)容 10
1.4 常用研究指標(biāo)的說明 10
第2章 啤酒酵母Y-14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化 11
2.1 材料 11
2.1.1 菌種： 11
2.1.2 培養(yǎng)基： 11
2.1.3 主要試劑 12
2.1.4 主要儀器 12
2.2 方法 12
2.2.1 菌株活化 13
2.2.2 種子搖瓶培養(yǎng) 13
2.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 13
2.2.4 菌種的保藏 13
2.2.5 DTNB法檢測(cè)GSH含量 13
2.2.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 13
2.3 結(jié)果與分析 14
2.3.1 顯著影響因素的篩選結(jié)果 14
2.3.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果 16
2.4 結(jié)論 19
第3章 啤酒酵母Y-14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件的優(yōu)化 20
3.1 材料 20
3.1.1 菌種： 20
3.1.2 培養(yǎng)基： 20
3.1.3 主要試劑 21
3.1.4 主要儀器 21
3.2 方法 21
3.2.1 啤酒酵母Y-14生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 21
3.2.2 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn) 21
3.2.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn) 21
3.2.4 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗(yàn) 22
3.2.5 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn) 22
3.2.6 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn) 22
3.2.7 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH的進(jìn)程試驗(yàn) 22
3.3 結(jié)果與分析 22
3.3.1 啤酒酵母Y-14生長(zhǎng)曲線的繪制 22
3.3.2 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 23
3.3.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 24
3.3.4 發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 24
3.3.5 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 25
3.3.6 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 26
3.3.7 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進(jìn)程曲線的繪制 27
3.4 結(jié)論 28
第4章10L自動(dòng)發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵的初探 29
4.1 材料 29
4.1.1 菌種： 29
4.1.2 培養(yǎng)基 29
4.1.3 主要試劑 30
4.1.4 主要儀器 30
4.2 方法 30
4.2.1 斜面種子培養(yǎng) 30
4.2.2 一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 31
4.2.3 二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 31
4.2.4發(fā)酵罐流加培養(yǎng)試驗(yàn) 31
4.2.5 分析方法 31
4.3 結(jié)果與討論 32
4.3.1 第一批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 32
4.3.2 第二批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 36
4.4 結(jié)論 40
第5章 啤酒酵母Y-14中還原型GSH的分離純化 41
5.1 材料 41
5.1.1 菌種 41
5.1.2 主要材料 42
5.1.3 主要設(shè)備 42
5.2 方法 42
5.2.1 GSH提取液的制備 42
5.2.2 檢測(cè)方法 42
5.2.3 相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算公式 42
5.2.4 D001大孔樹脂離子交換柱的試驗(yàn)流程 43
5.2.5 D001大孔樹脂分離GSH的研究 43
5.2.6 SephadexG-10凝膠柱的試驗(yàn)流程 44
5.2.7 SephadexG-10純化GSH的研究 45
5.3結(jié)果與分析 46
5.3.1 D001大孔樹脂分離GSH的研究結(jié)果 46
5.3.2 SephadexG-10脫鹽純化GSH的研究結(jié)果 50
5.3.3 SephadexG-10分級(jí)分離純化GSH的研究結(jié)果 53
5.4 結(jié)論 56
第6章 總結(jié)與展望 57
6.1 總結(jié) 57
6.2 創(chuàng)新點(diǎn) 58
6.3 展望 58
參考文獻(xiàn) 59
致  謝 64