利用RAPD、ISSR標(biāo)記分析鄂西柚種質(zhì)資源遺傳多樣性

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摘 要

我國(guó)是柑桔的起源中心和遺傳變異中心之一，柚的品種資源十分豐富。本研究以分布在鄂西的柚種質(zhì)資源為對(duì)象，利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行研究，分析鄂西柚品種（類型）的遺傳多樣性。結(jié)果如下:
1. 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)RAPD和ISSR工作分析程序，在對(duì)鄂西柚種質(zhì)資源分析時(shí)
作一些調(diào)整，如DNA提取，PCR反應(yīng)體系等細(xì)節(jié)。建立一套適合于分析柚種質(zhì)資源的RAPD和ISSR反應(yīng)體系。
2. 從120條RAPD隨機(jī)引物中篩選出22條在樣品間具多態(tài)性的10堿基隨
機(jī)引物，對(duì)鄂西柚種資源65份材料進(jìn)行RAPD分析，擴(kuò)增共產(chǎn)生207條RAPD標(biāo)記帶，其中多態(tài)性帶104條，多態(tài)性百分率為50.2％；從50條ISSR引物中共篩選出13條在所有樣品間均能產(chǎn)生清晰擴(kuò)增帶的ISSR引物，擴(kuò)增共產(chǎn)生136條ISSR標(biāo)記帶，其中多態(tài)性帶共82條，多態(tài)性百分率為60.3％。檢測(cè)效果表明，ISSR效果明顯高于RAPD。
3. 根據(jù)RAPD和ISSR結(jié)果聚類分析,表明鄂西柚種資源單株間的遺傳差明
顯。根據(jù)DNA標(biāo)記數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化遺傳距離矩陣所作UPGMA樹系圖表明，RAPD聚類結(jié)果和ISSR聚類結(jié)果均可將所有材料劃分為3大類群。 RAPD和ISSR聚類結(jié)果相似但不盡相同，分析認(rèn)為這可能是由于引物檢測(cè)機(jī)制不同而引起的差異。
研究表明，RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)都能較好的反應(yīng)各柚類型的遺傳差異，適于進(jìn)行遺傳距離相對(duì)較近的柚種內(nèi)各類型間的品系鑒定和遺傳相互關(guān)系分析。同時(shí)文中還就RAPD和ISSR技術(shù)方法問(wèn)題進(jìn)行了討論，并對(duì)鄂西柚種資源保護(hù)提出了一些策略。

關(guān)鍵詞
RAPD,ISSR,標(biāo)記分析,遺傳多樣性

ABSTRACT

China is one centre of origin, inheritance and variation of citrus. The resources of citrus grandis osbeck contain abundant variations. The genetic diversity of the citrus in western Hubei province was studied based on RAPD and ISSR analyses to these citrus.
1. According to molecular markers of RAPD and ISSR, some modifications have been adjusted to the protocols of evolution of western Hubei citrus germplasm, such as DNA extraction and PCR reaction system, etc. the result is to set up the reaction system of RAPD and ISSR fitting for analyzing evolution of citrus.
2. 10bp twenty-two primers were screened out from 120 random primers and were used to analyze with RAPD among 65 accessions, which generated 207 bands, of which polymorphic bands number was104, the percentage of polymorphism equaled 50.2%;13 primers, which could amplified clearly bands, were screened out from 100 ISSR primers. As a result, 136 bands were generated, of which polymorphic bands number was 82, the percentage of polymorphism was 60.3%. The conclusion indicates that ISSR is more effective than RAPD.
3. According to the clustering analysis of RAPD and ISSR’s results, it proved that there were large inherited differences among all kinds of citrus grandis osbeck resources, Moreover, there are obvious differences among ‘shatian’ pummelos. Two types of ‘shatian’ pummelos, ‘chang shou’ and ‘guang xi’, belong to different groups. It indicates that there are various asexual and sexual variations. The result of RAPD divided all accessions into three groups and ISSR into five. The results of RAPD and ISSR were different but similar. Perhaps it was caused by the different checking systems of primers.
The research proved that RAPD and ISSR molecular markers could show the genetic diversity among all sorts of pummelos well, identify the varieties and analyze the inherited relations each other between the closer inherited distance types. Also it discussed the analyses of technologies as well as systems of RAPD and ISSR, providing some suggestions for the protections of pummelos in western Hubei province.
Key words: pummelo gerplasm RAPD and ISSR inherited diversity

目 錄
摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
ABSTRACT•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
1. 前言••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
柚種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
1.2 DNA分子標(biāo)記在種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
1.3本實(shí)驗(yàn)的研究目的和意義••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••9
2. 材料和方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.1 實(shí)驗(yàn)材料••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
供試柚材料類型•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
主要儀器設(shè)備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
2.1.3 主要試劑••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
2.2 實(shí)驗(yàn)方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.1 DNA的提取，純化及檢測(cè)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
2.2.2 RAPD反應(yīng)體系••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
2.2.3 ISSR 反應(yīng)體系•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
2.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
3. 結(jié)果與分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.1 DNA提取結(jié)果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.2 RAPD 最佳反應(yīng)體系建立•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
3.2.1 模板DNA用量••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
3.2.2 Mg2+對(duì)PCR結(jié)果的影響••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.3 dNTPs對(duì)PCR結(jié)果的影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.2.4 PCR熱循環(huán)的反應(yīng)參數(shù)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
3.3 ISSR 最佳反應(yīng)體系建立••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
3.3.1 模板DNA濃度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.3.2 Mg2+對(duì)PCR結(jié)果的影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22
3.3.3 dNTPs對(duì)PCR的影響••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.3.4 退火溫度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.4 引物篩選結(jié)果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.5 RAPD和ISSR結(jié)果聚類分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
4. 討論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.1 關(guān)于RAPD與ISSR方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
4.2 鄂西柚種質(zhì)資源的遺傳多樣性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29
4.3 柚種質(zhì)資源保存建議•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••30


參 考 文 獻(xiàn)

[1]. 方德秋，柑橘分類研究的過(guò)去，現(xiàn)在及未來(lái)，武漢植物學(xué)研究，11（4）：375－382
[2]. 方德秋，章文才（1990），利用同工酶進(jìn)行柑橘起源進(jìn)化的研究，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文.
[3]. 方德秋，章文才，應(yīng)用同工酶進(jìn)行寬皮柑橘分類菊及其進(jìn)化研究，武漢植物學(xué)研究，1992，10(4):305-312
[4]. 胡春根（1999），柑桔遺傳多樣性德分子評(píng)價(jià)及起源分類研究，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文.
[5]. 半田高，柑桔形態(tài)性狀數(shù)量化分類研究，園藝學(xué)會(huì)雜志，1985，54（2）：145－154