Thermus thermophilus木糖異構(gòu)酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1.67萬(wàn)字 40頁(yè) 原創(chuàng)作品，已通過(guò)查重系統(tǒng)

摘 要

生物乙醇是一種環(huán)保的化石燃料替代能源。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一種通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重要資源之一。木質(zhì)纖維素能夠水解成單體己糖和戊糖，然而在半纖維素水解產(chǎn)物中最豐富的戊糖（高達(dá)40％）—木糖仍未被充分利用。木糖可通過(guò)生物途徑轉(zhuǎn)化為乙醇，基于這個(gè)原因，木糖的乙醇發(fā)酵受到了廣泛的關(guān)注。木糖異構(gòu)酶是木糖發(fā)酵生物乙醇途徑中的限速酶，本研究中，首先根據(jù)GenBank中的Thermus thermophilus菌木糖異構(gòu)酶基因(xylA)序列特點(diǎn)，利用VectorNTI軟件設(shè)計(jì)引物；提取出T. thermophilus菌的DNA，將其做為模板擴(kuò)增得到大小約為1.2kbp的基因片段，測(cè)序顯示其長(zhǎng)度為1164bp。利用Blast軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的序列相似度比對(duì)，得知該片段與T. thermophilusHB8相應(yīng)基因的相似性為100％。將PCR獲得得木糖異構(gòu)酶基因片段用限制性內(nèi)切酶消化后連接于載體pSE380，將得到的連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，利用藍(lán)白斑篩選選出呈白色的重組菌落。用IPTG誘導(dǎo)重組菌株，以含有空白pSE380質(zhì)粒的大腸桿菌BL21做為對(duì)照，得到非常明顯的42kDa特征蛋白條帶表達(dá)產(chǎn)物。提取在大腸桿菌BL21中的表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)Ni親合層析與Sephacryl S-300凝膠過(guò)濾分離純化處理，研究酶學(xué)性質(zhì)，最終測(cè)得重組木糖異構(gòu)酶的活性為19.6 U/mg，最適溫度和pH分別為80℃、8.0，Km和Vmax 的值分別為15.9 mM、22.8U/mg。該文研究結(jié)果可為木糖生產(chǎn)乙醇提供一定參考。


關(guān)鍵詞：木糖異構(gòu)酶，克隆表達(dá)，Thermus thermophilus，酶學(xué)性質(zhì)