副溶血弧菌tdh基因敲除研究
Studies on the knock-out of tdh gene of Vibrio parahaemolyticus

2萬(wàn)字 42頁(yè) 原創(chuàng)作品，已通過(guò)查重系統(tǒng)

摘要
副溶血弧菌是一種嗜鹽性細(xì)菌，存在于近海岸的海水和魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等產(chǎn)品中，可引起食物中毒，如腹瀉、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和心臟疾病等。副溶血弧菌的主要致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素，包括熱穩(wěn)定直接溶血素（TDH)、熱不穩(wěn)定溶血素(TLH)和TDH相對(duì)溶血毒素(TRH)。臨床分離的菌株大多是tdh+株，即神奈川實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性菌株，TDH被公認(rèn)為是副溶血弧菌最主要的致病因子。本研究利用pDS132自殺載體敲除副溶血弧菌的tdh基因，獲得tdh基因缺失菌株。此研究可望在降低副溶血弧菌毒性方面發(fā)揮一定的作用。
本課題主要研究結(jié)果如下：
（1）測(cè)定Vp-35，Vp-62，Vp-73在不同培養(yǎng)時(shí)段的OD值，并繪制了副溶血弧菌的生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)在不同的生長(zhǎng)時(shí)間段，tdh-菌株Vp-35的OD值明顯高于其他兩株tdh+菌株，而tdh+菌株Vp-62的OD較低。且在生長(zhǎng)30 h時(shí)，tdh-菌株的OD值與tdh+菌株之間存在顯著性差異。
（2）利用紙片擴(kuò)散法和牛津杯法測(cè)定Vp-35，Vp-62，Vp-73的耐藥性。Vp-35對(duì)氯霉素、頭孢哌酮、紅霉素的敏感度明顯高于Vp-62、Vp-73。氯霉素對(duì)三株菌的抑菌作用與卡那霉素、氨芐霉素、G418、新霉素之間有顯著性差異，即Vp對(duì)氯霉素最敏感。因此氯霉素是最佳的篩選標(biāo)記基因。
（3）采用融合PCR技術(shù)將tdh目的基因上下游同源臂融合。成功擴(kuò)增出tdh2的前后同源臂，并融合PCR，凝膠電泳證明Vp-73的融合產(chǎn)物。融合的片段大小約為800 bp，與PCR產(chǎn)物大小相符。但融合PCR產(chǎn)物凝膠電泳亮帶不夠明顯，需要進(jìn)一步鑒定。


關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；基因敲除；自殺載體；TDH；耐藥性