多糖－蛋白結(jié)合疫苗與核酸佐劑的研制及免疫特性研究
頁數(shù) 66 字數(shù) 39906
摘要
此為碩士研究論文
特異性多糖疫苗在抗病原體感染，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮了重要的作用。然而，多糖是T細胞非依賴型抗原，在體內(nèi)不能產(chǎn)生免疫記憶，對免疫功能低下者無明顯作用。新型多糖－蛋白結(jié)合疫苗能在體內(nèi)激活T細胞，改善多糖疫苗的功能，成為新型疫苗的研發(fā)熱點。
本工作研究了多糖－蛋白結(jié)合疫苗的制備方法和對多糖抗原免疫原性的保護措施。采用雙環(huán)氧試劑1,4-二丁醇二縮水甘油醚進行肺炎球菌莢膜多糖與蛋白BSA的結(jié)合?？疾炝饲v膜多糖/結(jié)合試劑配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等制備條件與莢膜多糖活化度的關(guān)系，建立了過程可控、質(zhì)量可控的制備工藝。通過嚴格控制制備條件，可有效地將莢膜多糖活化度控制在所需的數(shù)量級。
對不同活化度莢膜多糖的免疫原性研究結(jié)果表明，活化度的增加導致多糖免疫原性減弱。當多糖活化度低于10時，可有效地保持多糖的免疫原性。本實驗制備的莢膜多糖－蛋白的結(jié)合物中，相同多糖用量情況下，蛋白用量的增加能夠促進血清中抗多糖抗體類型由IgM向IgG轉(zhuǎn)變，分別提高結(jié)合物抗多糖、抗蛋白IgG抗體滴度。
本工作分別從肺炎球菌和大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化DNA，采用超聲波對所提取的細菌DNA進行物理降解，制備成大分子量（約21000bp）和小分子量（約400bp）的DNA佐劑。小鼠免疫實驗表明，細菌DNA佐劑使用安全，本實驗中大劑量腹腔注射未見小鼠有不良反應(yīng)。小分子量DNA佐劑的免疫增強作用弱于大分子量DNA佐劑，DNA分子在體內(nèi)的降解可能是其重要原因。采用氫氧化鋁膠體吸附可使其在體內(nèi)緩釋，極顯著地提高DNA佐劑的免疫增強作用。
研究了不同佐劑對多糖抗原、蛋白抗原和多糖－蛋白結(jié)合物抗原的免疫增強作用。氫氧化鋁佐劑能增加多糖－蛋白結(jié)合物誘生的抗多糖IgG抗體滴度，極其顯著地增加抗蛋白及抗結(jié)合物自身的IgG抗體滴度。細菌DNA佐劑的整體免疫增強作用弱于氫氧化鋁佐劑，但其能在體內(nèi)誘導Th1型免疫應(yīng)答，使IgG2a/IgG1比值上升，激活免疫細胞殺滅病原體。
以體外培養(yǎng)的脾細胞為模型，研究添加佐劑后脾細胞活性和TLR－9蛋白表達量的變化。體外實驗和體內(nèi)實驗結(jié)果具有可比性。提示脾細胞體外培養(yǎng)模型有可能作為佐劑篩選和佐劑作用機理研究的一種手段。
本研究對莢膜多糖－BSA結(jié)合疫苗制備及免疫原性和對DNA佐劑制備及免疫增強作用的研究結(jié)果對于下階段新型肺炎球菌莢膜多糖－外膜蛋白結(jié)合疫苗的研發(fā)提供了重要依據(jù)。
關(guān)鍵詞：莢膜多糖，蛋白，結(jié)合疫苗，細菌DNA，佐劑，脾細胞



目 錄
第一章 引 言 1
1.1 疫苗 1
1.1.1 多糖疫苗 1
1.1.2 蛋白疫苗 2
1.1.3 多糖－蛋白結(jié)合疫苗 2
1.1.4 抗肺炎球菌感染類疫苗 3
1.1.4.1 肺炎球菌 3
1.1.4.2 肺炎球菌的多糖疫苗 4
1.1.4.3 肺炎球菌的多糖－蛋白結(jié)合疫苗 4
1.2 多糖－蛋白結(jié)合疫苗的制備技術(shù) 5
1.2.1 結(jié)合疫苗制備技術(shù)的要求 6
1.2.2 雙環(huán)氧試劑結(jié)合法 6
1.3 佐劑 7
1.3.1 佐劑的作用 7
1.3.2 佐劑誘導的免疫應(yīng)答方式 8
1.3.3 傳統(tǒng)佐劑 9
1.3.3.1 福氏佐劑 9
1.3.3.2 含鋁佐劑 9
1.3.4 CpG 佐劑 10
1.3.4.1 CpG 佐劑的免疫機制 10
1.3.4.2 CpG 佐劑的構(gòu)效關(guān)系 12
1.3.4.3 CpG 佐劑的應(yīng)用 14
1.3.4.4 CpG佐劑的前景 14
1.4 本工作的主要研究內(nèi)容與主要創(chuàng)新點 16
1.4.1 主要研究內(nèi)容 16
1.4.2 主要創(chuàng)新點 16
第二章 多糖－蛋白結(jié)合疫苗制備及免疫原性研究 17
2.1 材料 17
2.1.1菌種 17
2.1.2 實驗動物 17
2.1.3 主要實驗儀器 17
2.1.4 主要實驗藥品 17
2.1.5 培養(yǎng)基 18
2.2 方法 18
2.2.1 肺炎球菌莢膜多糖的分離純化 18
2.2.1.1 肺炎球菌的培養(yǎng) 18
2.2.1.2 粗多糖的制備 18
2.2.1.3 離子交換層析法純化莢膜多糖 18
2.2.2 莢膜多糖－蛋白結(jié)合物的制備 19
2.2.3 檢測方法 19
2.2.3.1 多糖含量檢測 19
2.2.3.2 蛋白質(zhì)含量的檢測 19
2.2.3.3 活化多糖上活性結(jié)合基團數(shù)目的測定 20
2.2.3.4 SDS-PAGE電泳檢測 20
2.2.3.5 HPLC檢測 21
2.2.4 免疫原性的研究 22
2.2.4.1 小鼠免疫 22
2.2.4.2 抗體滴度的ELISA檢測（間接法） 22
2.2.4.3 數(shù)據(jù)分析 22
2.3 結(jié)果與討論 23
2.3.1 莢膜多糖的制備 23
2.3.2 肺炎球菌6B型莢膜多糖的特性鑒定 24
2.3.3 多糖－蛋白結(jié)合方法研究 24
2.3.3.1 多糖蛋白結(jié)合物的制備 24
2.3.3.2 結(jié)合產(chǎn)物的HPLC分析 25
2.3.3.3 多糖－蛋白結(jié)合產(chǎn)物的電泳分析 28
2.3.4 結(jié)合試劑用量與多糖活化時間對多糖活化度的影響 29
2.3.5 不同活化度對多糖的免疫原性的影響 29
2.3.6 不同多糖：蛋白結(jié)合比例結(jié)合物的制備及免疫原性研究 30
2.3.7 不同佐劑對多糖-蛋白結(jié)合物的免疫增強作用 33
2.4 小結(jié) 36
第三章 核酸佐劑的制備與免疫增強作用研究 37
3.1 材料 37
3.1.1菌種 37
3.1.2 實驗動物 37
3.1.3 主要實驗儀器 37
3.1.4 主要實驗藥品 37
3.2 方法 38
3.2.1 細菌總DNA的提取和純化 38
3.2.2 提取DNA純度的檢測 38
3.2.3 佐劑的制備 39
3.2.3.1 DNA 佐劑的制備 39
3.2.3.2 氫氧化鋁佐劑的制備 39
3.2.3.3 合成佐劑CPG－ODN的制備 39
3.2.3.4 混合佐劑的制備 39
3.2.4 佐劑免疫增強作用的考察 39
3.2.4.1小鼠免疫實驗 39
3.2.4.2 體外小鼠脾細胞刺激實驗 39
3.3 結(jié)果與討論 41
3.3.1 細菌總DNA的提取制備 41
3.3.2 提取DNA的特征分析 41
3.3.2.1 紫外掃描 41
3.3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 42
3.3.3 DNA佐劑對BSA抗原的免疫增強作用 43
3.3.3.1 大分子量DNA佐劑的免疫增強作用 43
3.3.3.2 小分子量DNA佐劑對BSA的免疫增強作用 44
3.3.4 DNA佐劑和其它佐劑對BSA抗原的免疫增強作用 45
3.3.5 DNA佐劑對小鼠脾細胞的刺激作用 46
3.3.6 DNA佐劑對TLR-9受體表達的增強作用 48
3.3.7 DNA佐劑和氫氧化鋁佐劑對多糖抗原的免疫增強作用 49
3.3.8 不同佐劑對不同抗原的免疫增強作用 50
3.4 小結(jié) 51
第四章 結(jié)論與展望 52
4.1 結(jié)論 52
4.2 展望 53
參考文獻 54
致 謝 60


參考文獻
[1]張欠欠,惠清發(fā),趙學忠.疫苗研制及應(yīng)用的研究現(xiàn)狀與展望.延安大學學報(自然科學版),2005, 24(4):78.
[2]董德祥主編.疫苗技術(shù)基礎(chǔ)與應(yīng)用.北京:化學工業(yè)出版社.2002.
[3]劉純杰.疫苗研制技術(shù)的現(xiàn)狀與展望.微生物學免疫學進展,2002,30(3):6264.
[4]董群,方積年.多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用.中國藥學雜志,2001,36(10):649.
[5]翟少欽,左之才.生物多糖免疫作用的研究進展及應(yīng)用.中獸醫(yī)學雜志, 2001,(3):2